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Generierte DNA in die Zelle bringen: Transformation von E. coli mittels Hitzeschock

Bei einer Transformation von E. coli wird Fremd-DNA in E. coli-Zellen eingebracht.
Je Transformationsansatz wurde ein Eppendorf-Reaktionsgefäß mit kompetenten E. coli-Zellen (zur Herstellung s. "Herstellung kompetenter E. coli-Zellen") auf Eis aufgetaut. Im Falle einer Retransformation, d.h. es werden Plasmide eingesetzt, die bereits aus E. coli-Zellen isoliert wurden, wurde 1 Ál Plasmidlösung hinzugegeben. Wurde DNA aus einer Ligation verwendet, so wurde der gesamte Ligationsansatz hinzugegeben. Nach Zugabe der DNA wurden die Zellen bei 4°C für 5 min inkubiert. Es folgte ein Hitzeschock bei 42°C für 45 Sekunden und eine erneute Inkubation bei 4°C für 5 min. Es wurden 800 Ál LB-Medium hinzugegeben und die E. coli-Zellen für 30-60 min bei 37°C kultiviert, damit die auf der eingesetzten DNA kodierte Antibiotikaresistenz ausgeprägt wird (Kur). Im Falle einer Retransformation wurden 50Ál der Kultur auf einer LBamp-Platte zur Kontrolle ausplattiert und mit dem Rest der Kultur eine LBamp-Flüssigkultur angesetzt. Die LBamp-Platte wurde über Nacht bei 37°C und die Flüssigkultur über Nacht bei 37°C und Schütteln kultiviert, woraufhin eine Isolation des eingesetzten Plasmides aus der Flüssigkultur möglich war (s. Plasmid Mini-Prep, Plasmid Midi-Prep). Im Falle einer Transformation mit einem Ligationsansatz wurde der gesamte Transformationsansatz ausplattiert: jeweils 50 Ál und der Rest der Kultur (950 Ál) auf zwei LBamp-Platten. Es folgte eine Kultivierung der beiden Platten über Nacht bei 37°C.
Die angegebenen Temperaturen beziehen sich auf den DH5 -Stamm. Beim SCS110-Stamm betrug die Kultivierungstemperatur für die Flüssigkultur 30°C, die Kulvitierung auf LBamp-Platten wurde bei Raumtemperatur durchgeführt und dauerte 2-3 Tage. Die niedrigere Temperatur wurde gewählt, da der Stamm SCS110 Methylierungsdefekte aufweist (SCS110 ist dam-, s. 2.1.2 Stämme) und somit Probleme bei der Replikation und der DNA-Reparatur auftreten. Durch Kultvierung bei 30°C verläuft das Wachstum langsamer, so dass den Zellen für Replikation und DNA-Reparatur zwischen den Zellteilungen mehr Zeit bleibt.
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