Empfänger auf die DNA-Aufnahme vorbereiten: Herstellung kompetenter E. coli-Zellen

Kompetente E. coli-Zellen können, durch einen Hitzeschock induziert, DNA aufnehmen und werden daher für die Verwendung in Transformationen hergestellt.

Es wurden 2 Vorkulturen von E. coli angesetzt (je 5 ml LB-Medium) und über Nacht bei 37°C und Schütteln kultiviert. Am nächsten morgen wurden 3 Kolben mit je 100ml SOC-Medium mit je 1 ml der Vorkulturen angeimpft. Die Hauptkulturen wurden bis zu einer OD600 von 0,4-0,5 bei 37°C und Schütteln kultiviert und danach auf Eis gestellt. Die Kulturen wurden in 2 getrennten 50ml-Röhrchen bei 4°C und 4.000 U/min für 10 min zentrifugiert und der Überstand bei jeder Zentrifugation verworfen, sodass jedes Röhrchen ein etwa gleich großes Pellet enthielt. Jedes Pellet wurde in 45 ml TFBI-Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde für 10 min auf Eis inkubiert und bei 4°C und 4.000 U/min für 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und jedes Pellet in 6 ml TFBII-Puffer resuspendiert. Die Suspension wurde in Aliquoten von 200 µl auf sterile Eppendorf-Reaktionsgefäße aufgeteilt und diese bei -80°C gelagert.

Die kompetenen E. coli-Zellen wurden auf Antibiotikaresistenz und Transformationseffizienz getestet.