SOE-PCR (splicing by overlapping extension PCR)

Bei einer SOE-PCR werden 3 DNA-Fragmente (A, B und C) und keine Primer eingesetzt. Das Fragment A besitzt mit dem Fragment B einen überlappenden Bereich von ca. 20 Bp. Das Fragment C überlappt mit dem Fragment B über einen gleich großen Bereich am anderen Ende des Fragmentes B. Im ersten Zyklus der SOE-PCR dienen die Fragmente A und C jeweils als Primer für das Fragment B und es entstehen die Fragmente A/B und B/C. Im zweiten Zyklus lagern sich die im ersten Zyklus entstandenen Fragmente A/B und B/C mit ihrem großen überlappenden Bereich zusammen und fungieren gegenseitig als Primer, so dass das Produkt A/B/C entsteht. Durch die Zugabe von endständigen Primern kann das resultierende Produkt amplifiziert werden.

Die für die SOE-PCR verwendeten Fragmente A, B und C sind selbst PCR-Produkte und müssen daher vor der Verwendung in der SOE-PCR von Primern gereinigt werden, um Nebenreaktionen zu vermeiden (s. Gelextraktion).

Es wurden für die SOE-PCR zwei verschiedene DNA-Polymerasen verwendet: Die Phusion-DNA-Polymerase von der Firma Finnzymes und die Bio-X-Act Short-DNA-Polymerase von der Firma Bioline.

Der Reaktionsansatz hatte zu Beginn ein Gesamtvolumen von 48 µl und enthielt den für die verwendete DNA-Polymerase benötigten Puffer (x1), dNTPs (1 µl einer 10mM-Lösung), die zu vervielfältigende DNA (je verschiedener DNA ca. 1 ng) und die DNA-Polymerase (2 U BIO-X-Act Short-DNA-Polymerase bzw. 1 U Phusion-DNA-Polymerase). Die SOE-PCR besteht aus zwei Reaktionsabschnitten:

Während die Temperatur auf 80°C gehalten wurde, wurde zu jedem Reaktionsansatz ein Gemisch aus den beiden endständigen Primern hinzugegeben (je Primer 1 µl einer 25 µM-Lösung).