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SOE-PCR (splicing by overlapping extension PCR)

Bei einer SOE-PCR werden 3 DNA-Fragmente (A, B und C) und keine Primer eingesetzt. Das Fragment A besitzt mit dem Fragment B einen überlappenden Bereich von ca. 20 Bp. Das Fragment C überlappt mit dem Fragment B über einen gleich großen Bereich am anderen Ende des Fragmentes B. Im ersten Zyklus der SOE-PCR dienen die Fragmente A und C jeweils als Primer für das Fragment B und es entstehen die Fragmente A/B und B/C. Im zweiten Zyklus lagern sich die im ersten Zyklus entstandenen Fragmente A/B und B/C mit ihrem großen überlappenden Bereich zusammen und fungieren gegenseitig als Primer, so dass das Produkt A/B/C entsteht. Durch die Zugabe von endständigen Primern kann das resultierende Produkt amplifiziert werden.
Die für die SOE-PCR verwendeten Fragmente A, B und C sind selbst PCR-Produkte und müssen daher vor der Verwendung in der SOE-PCR von Primern gereinigt werden, um Nebenreaktionen zu vermeiden (s. Gelextraktion).
Es wurden für die SOE-PCR zwei verschiedene DNA-Polymerasen verwendet: Die Phusion-DNA-Polymerase von der Firma Finnzymes und die Bio-X-Act Short-DNA-Polymerase von der Firma Bioline.
Der Reaktionsansatz hatte zu Beginn ein Gesamtvolumen von 48 Ál und enthielt den für die verwendete DNA-Polymerase benötigten Puffer (x1), dNTPs (1 Ál einer 10mM-Lösung), die zu vervielfältigende DNA (je verschiedener DNA ca. 1 ng) und die DNA-Polymerase (2 U BIO-X-Act Short-DNA-Polymerase bzw. 1 U Phusion-DNA-Polymerase). Die SOE-PCR besteht aus zwei Reaktionsabschnitten:

Zum Seitenanfang Erzeugung des Produktes aus 3 DNA-Fragmenten

DNA-PolymeraseBIO-X-Act Short || PhusionBIO-X-Act Short || Phusion
ArbeitsschrittTt
Anfangsdenaturierung95°C || 98°C30s
Denaturierung95°C || 98°C10s
Annealing55°C10s
Elongation68°C || 72°C80s || 30s
Temperatur halten80°Cvariabel
Während die Temperatur auf 80°C gehalten wurde, wurde zu jedem Reaktionsansatz ein Gemisch aus den beiden endständigen Primern hinzugegeben (je Primer 1 Ál einer 25 ÁM-Lösung).

Zum Seitenanfang Amplifikation des Produktes

DNA-PolymeraseBIO-X-Act Short || PhusionBIO-X-Act Short || Phusion
ArbeitsschrittTt
Denaturierung95°C || 98°C10s
Annealing55°C15s || 10s
Elongation68°C || 72°C150s || 30s
Endelongation68°C || 72°C5min
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