Zielprotein nachweisen: Western Blot

Der Western Blot ist ein immunologisches Verfahren zum Nachweis eines bestimmten Proteins nach der Auftrennung aus einem Proteingemisch mittels SDS-PAGE. Zur spezifischen Identifikation des Zielproteins werden an ein Visualisierungssystem gekoppelte Antikörper eingesetzt.

Nach Auftrennung der Proteine auf einem SDS-Polyacrylamid-Gel wurden diese in einem semi-dry-Verfahren auf eine Nitrocellulosemembran übertragen. Hierzu wurde zwischen Anode (unten) und Kathode (oben) der Western Blot-Kammer folgende Anordnung aufgebaut (von Anode zu Kathode): 2 Whatman-Papiere mit WesternI-Puffer, 1 Whatman-Papier mit WesternII-Puffer, eine Nitrocellulosemembran, das SDS-Polyacrylamidgel, 3 Whatman-Papiere mit WesternIII-Lösung. Die Anordnung der Nitrocellulosemembran und des SDS-Polyacrylamidgels ist dadurch bedingt, dass die Proteine in dem SDS-Polyacrylamidgel durch das SDS negativ geladen sind und daher in Richtung Anode wandern. Die Nitrocellulosemembran durfte nicht mit der Hand berührt werden und die gesamte Anordnung musste frei von Luftblasen sein. Die angelegte Spannung sollte 10 V nicht überschreiten. Die Stromstärke betrug 160 mA (entsprechen 0,8 A/cm2 Nitrocellulosemembran) und die Dauer der Proteinübertragung ca. 90 min.

Um nach dem Blotten Proteinbanden auf der Nitrocellulosemembran sichtbar zu machen, wurde diese für 1 min in Ponceau-S-Lösung geschwenkt und mehrmals mit Wasser gewaschen. Daraufhin wurde die Nitrocellulosemembran für 30-40 min TBS/0,1 % Triton 100 + 5 % Milchpulver unter Schütteln inkubiert, wodurch unspezifische Bindungen der Antikörper reduziert werden sollen (Blockade). Der primäre Antikörper (Antikörperlösung 1:1000 verdünnt in TBS/0,1 % Triton 100 + 5 % Milchpulver) wurde über Nacht inkubiert, der sekundäre Antikörper (Antikörperlösung 1:5000 verdünnt in TBS/0,1 % Triton 100 + 5 % Milchpulver) über einen Zeitraum von 4 Stunden. Zwischen und nach den Inkubationsschritten wurde die Nitrocellulosemembran einmal für 15 min und zweimal für 5 min mit TBS/0,1 % Triton 100 ohne Milchpulver gewaschen.

Entwickelt wurde der Blot mit "Pierce ECL Western Blotting Substrate". Die Einwirkungsdauer der 1:1-Mischung der working solutions betrug 1 min. Es wurden drei Filme verwendet, wobei die verschiedenen Filme für 1 min, 3 min und 5 min belichtet wurden. Es wurde eine Nassentwicklung durchgeführt. Die Entwicklungszeit richtete sich nach der Färbung der Filme (ca. 2 min). Diese wurde während der Entwicklung alle 20 Sekunden geprüft.