Generierte DNA in die Zelle bringen: Transformation von S. pombe
Bei einer Transformation wird die Spalthefe S. pombe zur Aufnahme eines DNA-Konstruktes gezwungen. Bei der DNA kann es sich entweder um ein Plasmid handeln, oder um ein lineares Fragment, welches homologe Bereiche zu einer definierten Region im Genom der S. pombe-Zellen besitzt (Deletionskassette, Insertionskassette) und über homologe Rekombination in diese Region integriert werden kann, wobei ein neuer S. pombe-Stamm entsteht. Die Beschreibung der Methode bezieht sich auf die zweite Anwendung.
Es wurde morgens je Stamm eine Vorkultur in 5 ml YEA-Medium angesetzt und bei 30° und Schütteln kultiviert. Abends erfolgte eine Zelldichtebestimmung und ein Animpfen von Hauptkulturen (50 ml YEA). Diese wurden so eingestellt, dass zu einem festgelegen Zeitpunkt am nächsten Tag eine Zelldichte von 1*107 Zellen/ml (= OD600 von 0,5) erreicht wurde:
Zelldichte(t2) = Zelldichte(t1) * 2(t2-t1)/T
t1: Zeit zum Ansetzen der Hauptkulturen; t2: Zeit zum Erreichen einer Zelldichte von 107 Zellen/ml; T: Generationszeit von S. pombe (es wurde T = 145 min verwendet)
Am nächsten morgen wurde über OD600-Messungen ermittelt, ob die gewünschte Zelldichte bereits erreicht war. Wenn die OD600 über 0,7 lag, konnte die Kultur nicht verwendet werden. War die gewünschte Zelldichte erreicht, so wurden die Zellen bei 3.000 U/min für 4 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet mit 20 ml Wasser gewaschen und erneut bei 3.000 U/min für 4 min zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 1 ml Wasser aufgenommen, in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, bei 4.000 U/min für 1 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde mit 300 µl TE-Lithiumacetat-Puffer aufgenommen und bei 30°C für 30 min inkubiert.
Es folgte die Zugabe von 10-20 µl DNA-Lösung (je nach Konzentration, bei Einsatz einer Plasmid-Lösung 1 µl) und 10 µl Carrier-DNA (5 µg/µl). Es wurde erneut bei 30°C für 30 min inkubiert, 1 ml PEG 40 %-TE-Lithiumacetat-Puffer hinzugegeben, bei 30°C für 30 min und bei 42°C für 30 min inkubiert. Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten wurde das Eppendorf-Reaktionsgefäß geschüttelt, um die sedimentierten Hefezellen wieder zu resuspendieren. Es wurde bei 4.000 U/min für 1 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet in 1 ml YEA-Medium aufgenommen und in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml YEA-Medium überführt. Die S. pombe-Zellen wurden bei 30°C und Schütteln für 2-3 Stunden kultiviert. In dieser Zeit soll das eingesetzte DNA-Fragment über homologe Rekombination in das Genom der Hefezellen integriert werden, und die auf dem DNA-Fragment kodierte Resistenz gegen einen Selektionsstoff ausgeprägt werden. Findet die Integration des DNA-Fragmentes nicht statt, so wird dieses durch Nukleasen abgebaut, so dass die Hefezellen keine Resistenz ausprägen und auf dem Selektionsmedium nicht überleben. Danach wurden die Kulturen bei 2.000 U/min für 5 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet in 150 µl Wasser resuspendiert und auf Selektivplatten ausplattiert. Diese wurden bei 30°C bis zum Sichtbarwerden der ersten Kolonien (2-3 Tage) gelagert. Diese Kolonien wurden nochmals per Einzelzellausstriche auf Selektivplatten übertragen und einem Rot/Weiß-Test unterzogen.
Es folgte die Zugabe von 10-20 µl DNA-Lösung (je nach Konzentration, bei Einsatz einer Plasmid-Lösung 1 µl) und 10 µl Carrier-DNA (5 µg/µl). Es wurde erneut bei 30°C für 30 min inkubiert, 1 ml PEG 40 %-TE-Lithiumacetat-Puffer hinzugegeben, bei 30°C für 30 min und bei 42°C für 30 min inkubiert. Zwischen den einzelnen Inkubationsschritten wurde das Eppendorf-Reaktionsgefäß geschüttelt, um die sedimentierten Hefezellen wieder zu resuspendieren. Es wurde bei 4.000 U/min für 1 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet in 1 ml YEA-Medium aufgenommen und in ein 15 ml Röhrchen mit 5 ml YEA-Medium überführt. Die S. pombe-Zellen wurden bei 30°C und Schütteln für 2-3 Stunden kultiviert. In dieser Zeit soll das eingesetzte DNA-Fragment über homologe Rekombination in das Genom der Hefezellen integriert werden, und die auf dem DNA-Fragment kodierte Resistenz gegen einen Selektionsstoff ausgeprägt werden. Findet die Integration des DNA-Fragmentes nicht statt, so wird dieses durch Nukleasen abgebaut, so dass die Hefezellen keine Resistenz ausprägen und auf dem Selektionsmedium nicht überleben. Danach wurden die Kulturen bei 2.000 U/min für 5 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet in 150 µl Wasser resuspendiert und auf Selektivplatten ausplattiert. Diese wurden bei 30°C bis zum Sichtbarwerden der ersten Kolonien (2-3 Tage) gelagert. Diese Kolonien wurden nochmals per Einzelzellausstriche auf Selektivplatten übertragen und einem Rot/Weiß-Test unterzogen.