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Proteine isolieren: Gesamtzellextrakt aus S. pombe (TCA-Prep)

Eine TCA-Präparation dient der Herstellung eines Gesamtzellextraktes aus der Spalthefe S. pombe. Ein Gesamtzellextrakt kann unter Anderem verwendet werden, um das Vorhandensein bestimmter Proteine mittels SDS-PAGE und Western Blot nachzuweisen.
Es wurden Kulturen von S. pombe in je 10 ml YEA-Medium angesetzt und bei 30°C und Schütteln über Nacht kultiviert. Die Kulturen wurden in der log-Phase bei einer OD600 zwischen 0,5 und 1 bei 5.000 U/min und Raumtemperatur für 2 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet mit 5 ml Wasser gewaschen, erneut bei 5.000 U/min für 2 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet in 500 Ál Wasser resuspendiert und in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt. Zum Zellaufschluss wurden 75 Ál einer NaOH/-ME-Lösung hinzugegeben und für 15 min auf Eis inkubiert. Es folgte die Zugabe von 75 Ál 55 % TCA-Lösung zur Denaturierung von Proteinen und die Inkubation für 10 min bei 4°C. Die Mischung wurde bei 4°C und 14.000 U/min für 10 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, erneut kurz zentrifugiert und der verbleibende Überstand mit einer Pipette entfernt. Das Pellet wurde in 50 Ál HU-Puffer/0,1 M DTT resuspendiert und bei einer Gelbfärbung mit 1 M Tris (pH 8,0) neutralisiert. Die Suspension wurde für 10 min auf 65°C erhitzt und bei 4°C gelagert. Mit dieser Suspension kann eine SDS-PAGE durchgeführt werden.
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