Proteingemisch auftrennen: SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)

Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese dient der Auftrennung von Proteinen. Die SDS-Polyacrylamidgele mit den aufgetrenten Proteinen können für einen Western Blot zur immunologischen Identifizierung eines bestimmten Proteins verwendet werden.

Es wurden 6 %ige SDS-Polyacrylamidgele hergestellt. Vor dem Vermischen der Gelkomponenten wurde die Apparatur zum Gießen der Gele zusammengebaut und mit Wasser auf Abdichtung getestet. Es wurde mit einem Kamm angepasst, bis zu welcher Höhe das Trenngel gegossen werden soll.

Zuerst wurden alle Zutaten für zwei Trenngele zusammengegeben: 21,2 ml Wasser, 10 ml 1,5 M Tris (pH 8,8), 8 ml 30 % Acryl-Bisacrylamid-Mix, 0,4 ml 10 % SDS, 0,4 ml 10 % Ammoniumpersulfat. Durch die Zugabe von 32 µl TEMED wurde die Polymerisationsreaktion gestartet. Die Mischung wurde zügig in die Gelkammer pipettiert und zwecks Ausschluss von Luftsauerstoff und Glättung der Oberfläche mit Isopropanol überschichtet. Nach Festigung des Trenngels (ca. 1 h) wurde das Isopropanol abgegossen.

Dann wurden die Zutaten für zwei Sammelgele zusammengegeben: 4,1 ml Wasser, 0,75 ml 1,5 M Tris (pH 6,8), 1 ml 30 % Acryl-Bisacrylamid-Mix, 60 µl 10 % SDS, 60 µl 10 % Ammoniumpersulfat, 6 µl TEMED. Nach Beimischung des TEMED wurde die Mischung zügig über die Sammelgelschicht pipettiert, Kämme zwischen die Glasplatten der Apparatur eingefügt und bis zur Erhärtung der Gele gewartet. Wenn die erhärteten Gele nicht sofort verwendet werden, können sie mitsamt Glasplatten und Abstandstreifen in ein feuchtes Papiertuch und Frischhaltefolie eingewickelt und in dieser Form bis zu vier Wochen bei 4°C gelagert werden.

Als Elektrophoresepuffer wurde 1x Laemmli-Puffer und als Molekulargewichtsmarker "SeeBlue Plus2" von Invitrogen verwendet. Die angelegte Spannung betrug 500 V, die Stromstärke 80 mA (für 2 Gele) und die Dauer der Elektrophorese ca. 90 min.