DNA schneiden: Analytischer / präparativer Restriktionsverdau

Ein Restriktionsverdau ist die Spaltung von DNA an gezielten Positionen. Beim analytischen Restriktionsverdau dienen die Spaltprodukte zur Überprüfung der eingesetzten DNA, beim präparativen Restriktionsverdau werden die Spaltprodukte für Klonierungen eingesetzt.

Die Reaktionsbedingungen (Puffer, Zugabe von BSA, Temperatur) der Restriktionsendonukleasen wurden den entsprechenden Katalogen (NEB, Promega) entnommen. Die Konzentration der Enzymlösungen betrug 10 U/µl.

Für einen analytischen Restiktionsverdau wurde ein Ansatz mit einem Gesamtvolumen von 20 µl mit folgenden Reaktionsbedingungen gewählt: 0,1-1 µg Plasmid-DNA (1 µl eines Midi-Prep-Produktes), 1xPuffer, 1xBSA (wenn benötigt), 5 U Enzym (0,5 µl einer 10 U/µl-Lösung). Bei einem präparativen Restriktionsverdau betrug das Gesamtvolumen 50 µl, wobei die Reaktionsbedingungen unverändert blieben, jedoch 3-30µg Plasmid-DNA (30 µl eines Midi-Prep-Produktes) und 30U Enzym (3 µl einer 10 U/µl-Lösung) eingesetzt wurden. Die Inkubationszeit betrug bei einem analytischen Restriktionsverdau 1-2 Stunden, bei einem präparativen Restriktionsverdau wurde über Nacht inkubiert. Die Reaktionstemperatur betrug in den meisten Fällen 37°C, Abweichungen sind in den oben genannten Katalogen angegeben. Bei präparativen Doppelverdauen wurden die Spaltungen hintereinander durchgeführt. Nach dem ersten Restriktionsverdau wurden die Restriktionsprodukte über eine Ethanolfällung gereinigt. Es wurde auf Eis pipettiert. Wenn es möglich war, wurden zum Einsparen von Pipettierschritten Mastermixes verwendet. Die Restriktionsendonuklease wurde zuletzt zum Ansatz hinzugegeben.