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Grundreaktion: Präparative PCR (Polymerasekettenreaktion)

Die PCR ist eine Methode zur Amplifikation gezielter DNA-Sequenzen, ausgehend von einem Plasmid oder einem linearen DNA-Strang, passenden Primern als Startstellen für die Kopierreaktion, dNTPs und dem Enzym DNA-Polymerase. Zur erfolgreichen Durchführung einer PCR sind Reaktionsparameter zu finden, welche von der Zielsequenz und der verwendeten DNA-Polymerase abhängen.
Es wurden für präparative PCR zwei verschiedene DNA-Polymerasen verwendet: Eine hauseigene Taq-DNA-Polymerase und die Phusion-DNA-Polymerase von der Firma Finnzymes. Jeder PCR-Ansatz hatte ein Gesamtvolumen von 50 Ál und enthielt den für die verwendete DNA-Polymerase benötigten Puffer (x1), dNTPs (1Ál einer 10mM-Lösung), zwei verschiedene Primer (je 1 Ál einer 25 ÁM-Lösung), die zu vervielfältigende DNA (10 100 ng) und die DNA-Polymerase (1 Ál einer Taq-DNA-Polymerase-Lösung bzw. 0,5 Ál einer 2 U/Ál-Phusion-DNA-Polymerase-Lösung).
Die Elongationsdauer wurde anhand der Geschwindigkeit der DNA-Polymerase gewählt. Als Richtwerte dienen für die Taq-DNA-Polymerase 1 kb/min und für die Phusion-DNA-Polymerase 2-4 kb/min. Es wurde folgendes Programm verwendet:
ArbeitsschrittTt
Anfangsdenaturierung98°C5min
Temperatur halten80°Cvariabel
Denaturierung95°C30s
Annealing55°C30s
Elongation72°C1min/kb
Endelongation72°C5min
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