Grundreaktion: Präparative PCR (Polymerasekettenreaktion)

Die PCR ist eine Methode zur Amplifikation gezielter DNA-Sequenzen, ausgehend von einem Plasmid oder einem linearen DNA-Strang, passenden Primern als Startstellen für die Kopierreaktion, dNTPs und dem Enzym DNA-Polymerase. Zur erfolgreichen Durchführung einer PCR sind Reaktionsparameter zu finden, welche von der Zielsequenz und der verwendeten DNA-Polymerase abhängen.

Es wurden für präparative PCR zwei verschiedene DNA-Polymerasen verwendet: Eine hauseigene Taq-DNA-Polymerase und die Phusion-DNA-Polymerase von der Firma Finnzymes. Jeder PCR-Ansatz hatte ein Gesamtvolumen von 50 µl und enthielt den für die verwendete DNA-Polymerase benötigten Puffer (x1), dNTPs (1µl einer 10mM-Lösung), zwei verschiedene Primer (je 1 µl einer 25 µM-Lösung), die zu vervielfältigende DNA (10 100 ng) und die DNA-Polymerase (1 µl einer Taq-DNA-Polymerase-Lösung bzw. 0,5 µl einer 2 U/µl-Phusion-DNA-Polymerase-Lösung).

Die Elongationsdauer wurde anhand der Geschwindigkeit der DNA-Polymerase gewählt. Als Richtwerte dienen für die Taq-DNA-Polymerase 1 kb/min und für die Phusion-DNA-Polymerase 2-4 kb/min. Es wurde folgendes Programm verwendet: