Schnittprodukte neu zusammenfügen: Ligation

Eine Ligation dient der Erzeugung von Plasmiden oder DNA-Strängen aus kleineren DNA-Fragmenten. Es wird eine DNA-Ligase (z.B. T4-DNA-Ligase) eingetzt, um aufgereinigte DNA-Restriktionsprodukte eines Restriktionsverdaus oder auf andere Weise erhaltene lineare DNA-Stränge zu einem längeren DNA-Strang bzw. zu einem Plasmid zusammenzufügen.

Für Ligationen wurde die T4-DNA-Ligase von NEB verwendet sowie der mitgelieferte ATP-haltige Puffer. Jeder Ansatz hatte ein Gesamtvolumen von 20 µl und enthielt den Puffer (x1), die gespaltene Vektor-DNA (1 µl), das DNA-Insert (5-10 µl, ein molares Verhältnis Insert:Vektor von mindestens 3:1) und die T4-DNA-Ligase (1U). Die Inkubation erfolgte bei 16°C in einer PCR-Maschine über Nacht.