Ist Gen X in Reparatur von DNA involviert? Drop dilution assay
Enthält eine Zelle eine defekte Version eines Gens, welches in einen bestimmten Pathway der DNA-Reparatur eingebunden ist, so ist sie besonders anfällig gegenüber DNA schädigenden Einflüssen, welche normalerweise von den beeinträchtigten DNA-Reparaturweg abgefangen werden. Dieser Sachverhalt wird im Drop dilution assay zur Charakterisierung der Funktion eines möglichen DNA-Reparatur-Gens und zur Kontrolle der Aktivität bereits bekannter DNA-Reparatur-Gene eingesetzt ausgenutzt. In diesem Assay wird die Sensitivität eines Stammes der Spalthefe S. pombe gegen verschiedene DNA schädigende Agenzien getestet.
Es wurden S. pombe-Vorkulturen in 5 ml YEA-Medium angesetzt und bei 30°C und Schütteln über Nacht kultiviert. War die Zelldichte morgens größer als 1*107 Zellen/ml, so wurde durch eine 1:10-Verdünnung aus den Vorkulturen Hauptkulturen angeimpft. Ansonsten wurden die Vorkulturen verwendet. Es folgte eine weitere vierstündige Kultivierung, damit sich die Zellen in der log-Phase befinden.
Währenddessen wurden die Platten mit den DNA schädigenden Agenzien (MMS und 4-NQO) vorbereitet. YEA-Medium + 1,6 % Agarose wurde autoklaviert. Nach dem Zugeben von 3 % Glucose und Abkühlung wurden die DNA schädigenden Agenzien hinzugegeben (0,0020 % MMS und 0,020 µg/ml 4-NQO) und die Platten gegossen.
Die Zelldichte der S. pombe-Kulturen wurde mit Hilfe einer Neubauer-Zählkammer bestimmt und auf 1*107 Zellen/ml eingestellt.
Von jeder Kultur wurden drei 1:10-Verdünnungen angefertigt und von allen Proben (107, 106, 105, 104 Zellen/ml) 10 µl auf je eine Platte mit den DNA schädigenden Agenzien sowie auf eine YEA-Platte als Kontrolle getröpfelt. Die Platten wurden bei 30°C inkubiert und das Wachstum nach 2 Tagen analysiert und durch Scannen dokumentiert.