Isolation chromosomaler DNA aus der Spalthefe S. pombe

Es wurde eine S. pombe-Kultur in 10 ml YEA angesetzt und bei 30°C und Schütteln über Nacht kultiviert. Die Kultur wurde bei 3.000 U/min für 4 min zentrifugiert, der Überstand verworfen, das Pellet in 10 ml Wasser gewaschen, erneut bei 3.000 U/min für 4 min zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 1 ml Wasser aufgenommen, in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und bei 13.000 U/min für 1 min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in 500 µl SCE-Puffer resuspendiert. Die im SCE-Puffer enthaltene Zymolyase bewirkt den Abbau von Zellwänden und das enthaltene DTT den Bruch von Disulfidbrücken. Dann wurde das Gemisch bei 13.000 U/min für 5 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in 500 µl Zelllysispuffer resuspendiert; es durfte nicht gevortext werden. Zur Zelllyse folgte eine Inkubation bei 60°C für 30 min. Es wurden zur Neutralisation und zum Ausfällen der Proteine 170 µl einer 5 M Kaliumacetat-Lösung hinzugegeben und bei 4°C für 60 min inkubiert. Daraufhin wurde bei 4°C und 13.000 U/min für 15 min zentrifugiert, der Überstand in ein neues Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt, erneut bei 4°C und 13.000 U/min für 15 min zentrifugiert und der Überstand in ein 2 ml-Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt.

Die nächsten Schritte umschließen die Ethanolfällung der DNA aus der erhaltenen Lösung: Das Eppendorf-Reaktionsgefäß wurde mit drei Volumenanteilen 96%igem eiskaltem Ethanol aufgefüllt und bei Raumtemperatur für 15 min inkubiert. Es wurde bei 4°C und 13.000 U/min für 10 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet mit 300µl 70%igem Ethanol gewaschen. Es wurde erneut bei 4°C und 13.000 U/min für 10 min zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet bei 37°C für 30 min getrocknet. Schließlich wurde das Pellet in 100 µl TE-Puffer + RNase (20 µg/ml) aufgenommen und für 10 min auf 65°C erhitzt. Die DNA-Lösung wurde bei 4°C gelagert.