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Suche nach den transformierten Bakterien: Colony-PCR-Screen

Ein Colony-PCR-Screen wird eingesetzt, um nach einer Transformation solche Bakterien zu identifizieren, welche die zur Transformation eingesetzte DNA aufgenommen haben. Da für die Durchführung eines Colony-PCR-Screens keine DNA isoliert werden muss, handelt es sich um eine Methode zur schnellen Identifikation erfolgreich transformierter Bakterien.
Für einen Colony-PCR-Screen wird keine isolierte DNA, sondern ganze Zellen eingesetzt. Nach einem Zellaufschluss liegt die DNA frei und kann in den folgenden Amplifikationsschritten als Vorlage dienen. Dieses Verfahren kann angewandt werden, um nach einer Klonierung diejenigen Zellen zu identifizieren, welche die eingesetzte DNA aufgenommen haben.
Es wurde für den Colony-PCR-Screen eine hauseigene Taq-Polymerase verwendet. Es wurden zwei Ansätze hergestellt. Der erste Ansatz hatte ein Gesamtvolumen von 30 Ál und enthielt den Taq-Polymerase-Puffer (x1). Der zweite Ansatz hatte ein Gesamtvolumen von 20 Ál und enthielt den Taq-Polymerase-Puffer (x1), dNTPs (1Ál einer 10mM-Lösung), zwei verschiedene Primer (je 0,5 Ál einer 25 ÁM-Lösung) und die Taq-DNA-Polymerase (1 Ál).
Von der zu prüfenden Kolonie wurde mit einer Pipettenspitze ein Teil auf eine LBamp Kontrollplatte übertragen und ein weiterer Teil in den ersten Ansatz überführt. Dieser wurde mit Mineralöl überschichtet. und in der PCR-Maschine zum Zellaufschluss für 5 min auf 98°C erhitzt. In der darauf folgenden Phase konstanter Temperatur (80°C) wurde der zweite Ansatz hinzugegeben und folgendes Programm durchgeführt:
ArbeitsschrittTt
Zellaufschluss98°C5min
Temperatur halten80°Cvariabel
Denaturierung95°C30s
Annealing55°C30s
Elongation72°C1min/kb
Endelongation72°C5min
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